论文推送金乌贼热休克蛋白基因的挖掘及对低

王兴强,郑年昊,崔春辉,曹梅,沈晔,刘莹,张子文,汤子威,秦传新,陈百尧.金乌贼热休克蛋白基因的挖掘及对低盐胁迫的响应[J].海洋科学,,45(3):59-70.

研究背景

近年来，通过分子生物学的技术手段发掘水生动物的优质功能基因，并通过基因克隆等手段加以应用成为研究热点。金乌贼(Sepiaesculenta)又名墨鱼、大鱿鱼，属于软体动物门、头足纲、乌贼目、乌贼科、乌贼属，是广温性洄游种类，广泛分布在渤海、黄海、东海、南海以及日本列岛附近海域。金乌贼对盐度要求苛刻，适盐范围在28~31，是我国重要的渔业资源。然而自上世纪末，因过度捕捞、海洋污染和天然栖息地的不断萎缩，金乌贼生物资源量急剧下降。为了恢复金乌贼种质资源，人工养殖迫在眉睫，然而在我国金乌贼人工繁育技术尚处于起步阶段，生物信息学方面的研究也较少，例如actin、HSP和crystallin等基因的研究尚未报道。这些功能基因的研究与开发，对后续金乌贼人工良种繁育、种质保护等方面有积极意义。

研究思路

本研究基于先前通过RNA-seq技术获得骤降15盐度的低盐胁迫6h后的金乌贼高通量转录组数据，对与低盐胁迫密切相关的HSPs和crystallin家族基因进行挖掘，同时挖掘出金乌贼actin家族系列基因，从分子水平探究actin、HSP和crystallin的进化水平及低盐胁迫对HSP和crystallin基因表达的影响，以期阐明金乌贼应答低盐胁迫的分子调控特征，为金乌贼分子标记的开发提供技术支撑。

研究结果

通过金乌贼actin家族基因氨基酸序列比对发现，6个成员共享甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和天冬氨酸等13个位点，表明actin家族基因在物种进化上高度保守且行使相类似的功能，不易随着环境因子的改变或年龄的变化而发生改变，适合在金乌贼基因表达研究中作为内参基因。通过进化树分析发现，金乌贼actin与内收肌actin、胞质actin、actinII、βactin和actin1关系较远，具体原因推测有三：一是actin基因较其它家族成员保守；二是内收肌actin、胞质actin、actinII和βactin4个成员得到对扩验证，而actin虽然进行了对扩，但没有出现对扩条带，可能与本基因拼接的精确度较低有关；三是actin碱基数bp，较其它家族成员长，可能基因内部有重复序列，从而影响了进化树的精确度。本研究挖掘出的金乌贼肌动蛋白、热休克蛋白和晶体蛋白家族基因经SMART预测无明显的信号肽与跨膜区域，没有信号肽的蛋白质不太可能暴露于N糖基化机制，所以肌动蛋白、热休克蛋白和晶体蛋白家族基因均无N糖基化位点，推测肌动蛋白、热休克蛋白和晶体蛋白家族蛋白在细胞质中富集且不属于膜蛋白，主要在细胞内发挥作用。

根据分子质量、序列同源性、结构和功能，HSPs基因通常被命名为HSP、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSP等，本研究挖掘出HSP和crystallin两个家族，金乌贼HSP家族基因包括HSPβ、小HSP、HSP10、HSP16、HSP30、HSP60、HSP70、HSP75、HSP90α、HSP90和HSP90β11个成员，而crystallin家族基因包括Scrystallin、Scrystallin6、ScrystallinSL18和Ocrystallin4个成员。先前研究发现，HSPs部分成员具有特有的ATPase活性，主要用于调节HSPs与蛋白质底物的关联和离解。本实验得到的HSP75、HSP90和HSP90α均具有ATPase结构域，因而推测可能具有ATPase的活性。

本研究挖掘出金乌贼3个S型crystallin和1个O型crystallin。一般来说，类群特异性crystallin与代谢酶有关。金乌贼Scrystallin、Scrystallin6和ScrystallinSL18均具有GST结构域；基于物种进化的原则，金乌贼Scrystallin、Scrystallin6和ScrystallinSL18可能具有酶的活性，以上3个基因可能来源于GST的基因复制和随后的突变碱基替换。虽然Ocrystallin不具有GST结构域，但氨基酸序列比对发现，crystallin家族4个基因成员共享苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、丝氨酸和半胱氨酸等17个位点；相对而言，HSP家族HSPβ、小HSP、HSP10、HSP16和HSP个基因共享1个甘氨酸位点和4个保守位点，HSP60、HSP70、HSP75、HSP90α、HSP90和HSP90β6个基因仅共享2个保守位点，表明在金乌贼中，crystallin家族基因较HSP家族保守。

结论

低盐胁迫可以明显提高金乌贼HSPβ、HSP16、HSP30和HSP70的基因表达，而明显降低crystallin家族基因的表达，表明在低盐胁迫条件下，金乌贼HSPs和crystallin家族基因通过自身的差异表达来提高机体对外界胁迫的适应防御能力，因而本研究挖掘的HSPs和crystallin基因在研究金乌贼的抗环境胁迫方面有非常重要的意义。关于低盐胁迫对crystallin家族基因表达的影响，目前还未见相关报道。HSPs部分成员具有ATPase结构域，而crystallin部分成员具有GST结构域，推测低盐胁迫可改变金乌贼ATP酶的活性，降低谷胱甘肽硫转移酶的解毒能力，有可能提高金乌贼对环境的敏感性。本实验的结果可为今后进行头足类低盐胁迫生理机制的探讨、分子标记的开发和关键基因的克隆等提供参考。

图1金乌贼基因家族结构域分析

(a)金乌贼actin基因家族多序列比对

(b)金乌贼HSP基因家族多序列比对

(c)金乌贼crystallin基因家族多序列比对

图2金乌贼肌动蛋白、热休克蛋白和晶体蛋白家族基因多序列比对

(a)actin基因家族系统进化树

(b)HSP基因家族系统进化树

(c)Crystallin基因家族系统进化树

图3金乌贼肌动蛋白、热休克蛋白和晶体蛋白家族基因系统进化树

表1金乌贼基因家族核苷酸和氨基酸序列分析

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